El tema cuatro no tengo bemoles a hacerlo, con tanta grafica de Lineawer-Burk y demás.
Tema 5. Significancia de los parametros cineticos Kcat, Km y Kcat/Km.
Kcat:
Número de ciclos cataliticos por unidad de tiempo (en segundos-1) Indica el numero de moleculas de sustrato transformadas a producto por molecula de E y unidad de tiempo (el enzima esta saturado)
Kcat: 100 sec-1 (una mlecula de enzima transforma 100 moleculas de sustrato en un segundo)
Una elevada Kcat representa una elevada velocidad. El valor de kcat siempre es el limite inferior de las constantes de velocidad unimolecular en el sentido sutrato a producto.
Km:
Tiene unidades de concentración. Es la concentracion de sustrato a la cual la velocidad es la mitad de Vm.Tambien se conoce como constante de saturabilidad.
Km es una constante de disociacion aparente que nos brinda informacion sobre la afinidad del enzima hacia el sustrato: cuanto mas pequeña es la Km mayor afinidad del enzima hacia el sustrato.
Kcat / Km:
Nos da la eficiencia catalitica del enzima (cuan bueno es) Nos informa de la especificidad enzimatica sobre varios sustratos. Sus unidades son M-1· Sec-1
No puedo dejar este resumen sin la cancionzaca.
TEMA 6: Inhibicion de la catalisis enzimática: tipo de inhibidores.
En este tema voy a omitir graficas, asi que quedara un poco bluf, pero bueno.
Inhibidores: sustancias que disminuyen la velocidad de las reacciones enzimáticas. Son utiles para esclarecer el mecanismo de actuacion enzimatica, tener datos de la estructura del centro activo y para el desarrollo de farmacos.
Tipo de inhibidores:
I. INHIBIDORES REVERSIBLES: Se notan sus efectos a concentraciones elevadas de inhibidor, pues se unen debilmente al E.
I.I COMPETITIVOS. Generalmente su estructura es similar a la del sustrato. I.II ACOMPETITIVOS I.III MIXTOS (los no competitivos son una subclase de mixto)
II. INHIBIDORES PSEUDOIRREVERSIBLES: Se notan sus efectos a concentraciones de inhibidor similares a la del enzima.
III. INHIBIDORES IRREVERSIBLES. Se pierde la actividad enzimatica, pues en inhibidor se une fuertemente (de manera covalente)
Esto sin las graficas de Dixon y Cornish Bowden se queda en ná. :(
IC50: Representa la concentracion de inhibidor requerida para apreciar un 50% de inhibicion. El IC50 depende de la concentracion de sustrato excepto en el caso de inhibicion no competitiva.
Dedicado a mi buen amigo Lluis, que no se muy bien porqué pero no parecen entretenerle demasiado los resumenes que realizo.
Animo Lluis! ¿Que quieres que escriba yo ahora en el Blog que no sea precisamente en lo que tengo ocupado el 95% de mis dos hemisferios cerebrales? (el otro cinco por ciento es para una chica guapisisima que esta sentada a un metro de mi en diagonal y que me está distrayendo con su molesta belleza)
Bueno, alla va:
Tema 3: Técnicas de ensayo de los enzimas.
La actividad enzimatica se expresa como cantidad de sustrato o producto transformado o generado en funcion del tiempo necesario.
Las unidades de actividad (U) suelen expresarse como micromol entre minuto, pese a que el el sistema internacional de unidades se expresa en katal (kat) (= mol/segundo)y supne la cantidad de enzima necesaria para transformar los moles de sustrato a producri por segundo.
Para facilitar el calculo tambien se puede calcular por incremento de absorbancia respecto a tiempo.
El metodo que escojamos para estudiar la actividad enzimaica nos debe permitir trabajar en condiciones de estabilidad del enzima.
-METODO EN SISTEMA CONTINUO: Vemos todo el proceso a lo largo del tiempo.
-METODO EN SITEMA DISCONTINUO: Detenemos el proceso a tiempo determinado para hacer el ensayo.
METODOS:
I. ESPECTROMETRIA:
Ha de haber un componente que aparezca o desaparezca y que con ello cambie su espectro. Calculando el incremento de absorbancia respecto tiempo podemos determinar la actividad enzimatica.
II. CROMOFOROS SINTETICOS.
Sin ser el sustrato natural del enzima se ven modificados por este y dar cambios en el espectro.
III. REACCIONES ACOPLADAS.
Si no tenemos ningun componente de la reacción que de un cambio en el espectro de absorbancia podemos utilizar una segunda reaccion en el que el producto de la primera sea sutrato para esta, con la ventaja que en este caso si disponemos de un componente (habitualmente el NADH) que si da cambio en el espectro.
Hemos de tener enzima y NADH en exceso y tener en cuenta la estequiometria.
IV: FLUORESCENCIA.
Similar al anterior pero con instrumental menos frecuente y mas caro.
V. TURBIDIMETRIA.
Util especialmente para determinar la actividad de enzimas relacionados con la ruptura de la pared bacteriana.
VI. ENSAYO ELECTROQUIMICO.
Indicado cuando en la reaccio hay cambio en la concentracion de protones. Se utilizan electrodos para ver la diferencia. Se suele utilizar en continuo.
VII. ENSAYO RADIOMETRICO.
Actuan en discontinuo. Se basan en la presencia de isotopos radiactivos en una parte de la muestra.
VIII. HPLC.
Discontinuo. Se puede hacer en digestion de productos polimericos donde vamos viendo los grados de degradacion.
IX. ELECTROFORESIS.
El sustrato corre con la enzima, una vez hecha la separacion ponemos el gel a incubar en las condiciones optimas para el enzima de manera que teñiendo el sustrato veremos vacios en el lugar donde esta el enzima (?)
Para hablar de velocidad inicial hemos de trabajar a tiempos de reaccion cortos (asi la variacion de la concentracion de sustrat es despreciable) ademas la concentracion de enzima ha de ser fija e inferior a la de sustrato.
ORDEN DE REACCION
Cuando la velocidad de la enzima ya no depende de la concentracion de sustrato tenemos orden cero.
Cuando la reaccion no es lineal podemos apreciar dos comportamientos:
CINETICA BURST. la velocidad aumenta o disminuye al cabo de un tiepo corto de reaccion. CINETICA LAG. La reaccion comienza lenta y luego se dispara.
Esto puede ser debido a una temperatura inadecuada, a particulas en suspension, a detectores de respuesta lenta, etc.
PURIFICACION ENZIMATICA.
El enzima ha de ser estable, segun la fuente el proceso de purificacion será distinto. (fuentes: celulas eucariotas, fermentacon bacteriana, latex de plantas)
Metodos para la purificacion se basan en propiedades fisicoquimicas del enzima:
EL proceso a escoger ha de tener las menos etapas posibles y poniendo en primer lugar aquellas que separen con menos eficiencia mayor cantidad de producto. (las etapas mas especificas al final)
SISTEMAS DE EXPRESION DE PROTEINAS RECOMBINANTES:
Bacterias: levaduras; celulas de insecto con vectores baculovirus.
Y hasta aqui puedo leer. Para que no todo sea un tostón infumable para mi buen amigo Lluis, añado una bonica cancion de esas que escucho cuando hago estos resumenes.
Gracias a todos los que me han dado animos estos dias!
He perdido la buena costumbre de hacer resumenes despues de cada dia de estudio y eso no se puede permitir. Aqui va un resumen del tema 12.
TEMA 12: ESPECIFICIDAD ENZIMATICA Y CENTRO ACTIVO.
CENTRO ACTIVO.
El centro activo es la región de la estructura de la proteina que contiene los grupos que unen al sustrato, asi como los que unen a los cofactores que fuerennecesarios y aquellos grupos quimicos que participan en la catalisis.
Un mismo grupo del centro activo puede intervenir tanto en la union como en el mecanismo. Estas interacciones enzima-sustrato son la base estructural que explica la disminucion de la energia de activacion en las reacciones catalizadas.
I. ESTRUCTURA.
Pese a que las estructuras proteicas difieren bastante entre si, hay caracteristicas comunes en los centros activos de los enzimas.
I.I. Estructura de cavidad: Formada por grupos cercanos en el espacio (que no en la secuencia) I.II. Fuerzas no covalentes. Para que se una el sustrato, pero sin ser muy fuertes para que se disocie el producto. I.III. Estabilizacion del estado de transicion: Favorecen que el sustrato llegue a este estado por fijacion de este al enzima. Interacciones debiles pero especificas.
II. TEORIAS SOBRE EL ACOPLAMIENTO ENZIMA - SUSTRATO:
II.I Teoria de Fischer (llave y cerradura) El proceso de catalisis viene determinado por la complementariedad existente entre el enzima y el sustrato.
II.II Modelo de Koshland (acoplamiento inducido)
En el proceso de union y catalisis se produce un cambio en la estructura del enzima cuando se fija el sustrato (Ejemplo: hexoquinasa)
II.III teoria de Haldane (tension sobre el sustrato)
Implica que al formarse el complejo E-S se forma una tension al sustrato, ademas del cambio de conformacion del enzima. tanto esta teoria como la anterior implican flexibilidad. La flexibilidad de la proteina y del centro activo: esta asociada a la temperatura de fusion que depende de los enlaces que la mantienen plegada.
II.IV hipotesis de union a tres puntos (estereo-especificidad)
Especificidad para los isomeros. La fijacion del sustrato al C.A. es debida a la estereoespecificidad.
¿Que funcion tiene la parte proteica que no es centro activo?
-Contribuye a la estructura de la molecula. -Forma centros de regulacion. -Cuando el CA es muy interno ayuda a interiorizar el sustrato.
III. TRES MODELOS PARA EXPLICAR LA CATALISIS DEL C.A.
III.I Centro activo que contribuye a la catalisis por factores de proximidad:
La enzima aproxima los grupos reactivos de los sustratos, permitiendo que se produzcan interacciones especificas. El enzima no participa en el mecanismo, solo acerca los grupos que reaccionarian de toddas formas.
III.II El centro activo desestabiliza al sustrato por interacciones entre el enzima y el sustrato:
Provoca un cambio de conformacion en el sustrato. La nueva conformacion del S asociado al E promueve la reaccion de catalisis. (en este caso participa en el mecanismo)
III.III El C.A. Estabiliza el estado de transicion:
Es el mas comun. La estructura del C.A. favorece que los sustratos lleguen al estado de transicion.
IV. EFECTO DE LA ENERGIA DE UNION EN LA CATALISIS ENZIMATICA.
Abzimas.
V. Enzimas con diversos subsetis de fijacion al sustrato.
Vi. Enzima perfectamente evolucionado. Vi.I Eficacia catalitica. Vi.II Capacidad de regulacion de la actividad. Vi. III Evitan la formacion de productos no deseados.
Es un tanto complicado hacer un resumen de enzimologia. Al menos si nos referimos a las cuestiones mas abstractas y basadas en formulaciones matematicas. Por ello voy a centrarme exclusivamente en la parte mas general.
TEMA I y II INTRODUCCION.
Las enzimas son proteinas que catalizan reacciones biologicas. A pesar de que su mecanismo y estructura eran desconocidas hasta hace poco, se utilizaban desde antiguo para fabricar cerveza, vino o pan, por ejemplo.
La aparicion de la tecnica recombinante ha permitido obtener enzimas que antes seria imposible de obtener.
Las enzimas no son especificas de un determinado isomero. En algunas actividades enzimaticas esta asociado un acido nucleico (ver ribozimas)
TERMINOLOGIA
Enzima: proteina que actua como catalizador de una reaccion. El efecto sobre la actividad catalitica se produce por un mecanismo de activacion. El enzima se recupera despues de la catalisis.
Centro activo: Lugar (en el enzima) donde tiene lugar la reacción. Las reacciones E-S se dan mediante interacciones no covalentes, esto solo sucede si el enzima esta plegado en su forma activa.
Eficiencia: Cada enzima tiene una eficiencia determinada, y esta sometida a las condiciones de la reaccion. Sustrato: moleculas que son catalizadas por el enzima. Serian los "reactivos"
Inhibidor/activador: moleculas que por si mismas no participan en la reaccion pero sí que regulan la actividad enzimatica (apoyan o impiden la catalisis)
Cofactores/ grupos prosteticos/ coenzimas: Son particulas no proteicas que participan en la reaccion enzimatica (los grupos prosteticos interaccionan fuertemente, miestras que los cofactores no)Un ejemplo de coenzima seria en NAD, una molecula orgánica que resulta modificada tras la reaccion.
Actividad enzimatica: Capacidad para catalizar una reacción. Se calcula en unas determinadas condiciones.
MECANISMO
Un enzima no actua sobre la espontaneidad de la reaccion (asociado al signo de la energia de Gibbs) si no que actua sobra la energia de activacion, lo cual entronca con su cinetica. La energia de Gibbs máxima que podemos apreciar se corresponde con la energia del estado de transición (en ese momento la reaccion seria termodinamicamente desfavorable) El objeto de la enzima es rebajar esta energia de activacion para acelerar el proceso.
-Demostracion de la formacion del TS:
1.- Prueba cinética: al representa velocidad maxima frente concetracion de sustrato se aprecia como la curva es hiperbolica: hay un momento de la reacción que aunque aumentemos la concentración de sustrato la velocidad maxima no puede aumentar más.
2.- Prueba estructural: Por cristalografias de interacciones enzima sustrato.
3.- Cambios en el espectro de fluorescencia (esto no lo he entendido)
CLASIFICACION ENZIMATICA: EC 1.1.1 Las enzimas se clasifican en base a su actividad. Un enxima con dos actividades lo encontraremos dos veces en la clasificacion.
Clases de actividad: 1.-Oxidoreductasas: transfieren o captan electrones para oxidar o reducir el S. 2.-Transferasas: Transfieren algun grupo de un S a otro (ejemplo: quinasas) 3.-Hidrolasas: aceleran reacciones de hidrolisis. 4.-Liasas: rompen enlaces sin que tenga que ver reacciones antes mencionadas 5.-Isomerasas: interconvierten isomeros. 6.-Ligasas o sintetasas.
Code enzim: EL enzima tiene un nombre sistematico que nos informa de sus sustratos y la reaccion que cataliza.
De hecho es el tema seis de clínica, el de hidratos de carbono, pero he preferido titular esta entrada como Diabetes Mellitus porque se centra mas en esta patologia y ademas es un tema compartido por varias asignaturas.
Algunas cosas que se repetian en el resumen anterior las he omitido, espero que a alguien le pueda servir de ayuda.
Tema 6: Metabolismo de los hidratos de carbono.
INTRODUCCION:
Los hidratos de carbonos son la principal fuente de energia del organismo. Se absorben en el intestino delgado y pasan a la sangre para ser distribuidos por los distintos tejidos. Cuando hay exceso de glucosa exogena se almacena en el higado en forma de glicogeno tras la señal en forma de insulina secretada por el pancreas. Cuando se necesita aumentar la concentracion de glucosa sanguinea, el pancreas secreta glicogeno y el higado responde degradando glicogeno, entre otras reacciones que aumentan la glucosa disponible.
Los hidratos de carbono se hidrolizan por accion de la amilasa, que transforma el almidon (disacarido) en glucosa; el azucar en fructosa y glucosa y la lactosa en glucosa y galactosa.
INSULINA.
La insulina se sintetiza en los islotes de langerhans pancreaticos. Las células alfa producen glucagon y las beta insulina. La insulina se sintetiza en forma de pre-pro-insulina. De la proinsulina se elimina el peptido C para dar la insulina madura.
La insulina provoca los siguientes efectos: -Estimula la entrada e glucosa en las celulas. -Estimula la gluconeogenesis (almacenaje de glucosa en forma de glucogeno) y la glucolisis. -Favorece la sintesis de Ac.Grasos e inhibe la lipolisis. -Activa la sintesis de proteina.
GLUCAGON.
Cuando la glucosa en sangre es baja, deja de secretarse insulina y se secreta glucagon. En hipoglucemia (a causa de ayuno) las celulas dejan de usar glucosa y usan acidos grasos como combustible. En el higado se sintetiza glucosa a partir de glucogeno.
Otras hormonas estimuladad por hipoglucemia son la adrenalina, la hormona del crecimiento someostatina (?) y el cortisol.
DIABETES MELLITUS.
Un 4 a 6 % de la poblacion mundial la padece, siendo previsible que vaya a más. Hoy por hoy es la 7ª causa de mortalidad mundial. Afecta al metabolismo de glucidos, acidos grasos y proteina.
Es un caso de hiperglucemia. El primer efecto es la perdida de glucosa por la orina (glucosuria) que provoca un aumento de la osmolaridad de los tubulos renales. Esto hace que perdamos mas agua en orina (diuresis) y polidipsia (mucha sed) Otros efectos de la glucosuria son la poliuria (mucha orina) la hemodilucion (paso de agua de las celulas a la sangre) y cetoacidosis (desequilibrio acido base)
DIABETES TIPO I
Afecta a niños y a jovenes. Representa un 10 a 15 % de los enfermos de diabetes. Es una enfermedad aguda, de aparicion brusca.
La ausencia de respuesta a insulina resulta total. Bien por falta de sintesis o por imposible interaccion con sus receptores. Como consecuencia la concentracion de glucosa sanguinea se eleva. Se produce por una alteracion autoinmune que provoca una destruccion de las celulas beta pancreaticas.
DIABETES TIPO II
Es el tipo mas frecuente. Los individuos pueden tener una sintesis disminuida o un no reconocimiento por parte de los receptores. La aparicion de los sintomas es mas lenta, en algunos casos asintomatica. Hay dos factores de riesgo: genético y ambiental (obesidad, edad, etc) la enfermedad se controla con dieta y farmacos hipoglucemicos.
DIABETES SECUNDARIAS.
Se da como efecto de otras enfermedades. Por ejemplo enfermedades pancreaticas, endocrinologicas, congenitas (S.de Down) o bien por fármacos.
DIABETES GESTACIONAL.
Un 4 a 10 % de mujeres embarazadas la sufren. Es importante diagnosticarla a tiempo para evitar el aborto.
Consecuencias de una diabetes mal tratada: -RETINOPATIA: Alteracion vascular de los vasos de la retina (puede acabar en ceguera) -NEFROPATIA DIABETICA: Alteracion de los vasos del riñon, que puede llevar a dialisis o a transplante de riñon (por insuficiencia renal) -ARTERIOESCLEROSIS VASCULAR: Afecta a las arterias.
(Ahora tocaria repetir mucho de lo comentado en el tema de la funcion renal sobre consumo de aminoacidos para formar cuerpos cetonicos, etc. pero no son horas)
ENSAYO DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA
1-Se toma sanrre del paciente en ayuno (Gluc basal) 2-Se añaden 75g de glucosa (administracion oral) 3-Si los niveles de glucosa suben mucho y se mantienen por largo tiempo, habra diabetes.
Un nivel basal normal de glucosa en ayuno sera de 5 mmol / L. Un paciente diabetico tendra un valor de unos 7,5 mmol / L.
PRUEBA O’SULLIVAN.
Para mujeres embarazadas entre la semana 24 a 27 (preventivo) se administra oralmente 50 g de glucosa y se mide tras una hora (no se mide la glucosa basal) si da positivo se realiza una segunda prueba con 100 gramos tras tres horas.
GLICOHEMOGLOBINA.
La glucosa en sangre interacciona con aminoacidos de proteinas de la sangre (Hb) de manera que la glucosa se une al grupo amino de una Valina en el extremo N terminal de las cadenas beta.
Cuando la concentracion de glucosa es elevada, la hemoglobina tiene tendencia a glicosilarse. De hecho la cantidad de Hb glicosilada depende de la concentracion de glucosa en sangre de los ultimos meses, asi que es una forma de seguir la enfermedad.
LA determinacion se puede hacer por: -1 Cromatografia de intercambio ionico (microcromatografia o HPLC) -2 Cromatografia de afinidad. -3 Inmunoanalisis. (Ab que reconocen Hb glicosilada)
De momento lo dejo aquí, faltaria completarlo con procedimientos de medida de la concentracion de glucosa mediante en producto de la actividad enzimatica (Glucosa Oxidasa/Peroxidasa; GDH; Hexoquinasa/ G-6-PDH) Tambien el apartado dedicado a hipoglucemia (Basal y reactiva en adultos; neonatal, acompañada de hiperinsulinemia o congenita en niños) y los protocolos clinicos frente a la diabetes.
Ah, no podia faltar la canción. Chamo, estos son los Radiohead de los que te hable ayer:
