Animo Lluis! ¿Que quieres que escriba yo ahora en el Blog que no sea precisamente en lo que tengo ocupado el 95% de mis dos hemisferios cerebrales? (el otro cinco por ciento es para una chica guapisisima que esta sentada a un metro de mi en diagonal y que me está distrayendo con su molesta belleza)
Bueno, alla va:
Tema 3: Técnicas de ensayo de los enzimas.
La actividad enzimatica se expresa como cantidad de sustrato o producto transformado o generado en funcion del tiempo necesario.
Las unidades de actividad (U) suelen expresarse como micromol entre minuto, pese a que el el sistema internacional de unidades se expresa en katal (kat) (= mol/segundo)y supne la cantidad de enzima necesaria para transformar los moles de sustrato a producri por segundo.
Para facilitar el calculo tambien se puede calcular por incremento de absorbancia respecto a tiempo.
El metodo que escojamos para estudiar la actividad enzimaica nos debe permitir trabajar en condiciones de estabilidad del enzima.
-METODO EN SISTEMA CONTINUO: Vemos todo el proceso a lo largo del tiempo.
-METODO EN SITEMA DISCONTINUO: Detenemos el proceso a tiempo determinado para hacer el ensayo.
METODOS:
I. ESPECTROMETRIA:
Ha de haber un componente que aparezca o desaparezca y que con ello cambie su espectro. Calculando el incremento de absorbancia respecto tiempo podemos determinar la actividad enzimatica.
II. CROMOFOROS SINTETICOS.
Sin ser el sustrato natural del enzima se ven modificados por este y dar cambios en el espectro.
III. REACCIONES ACOPLADAS.
Si no tenemos ningun componente de la reacción que de un cambio en el espectro de absorbancia podemos utilizar una segunda reaccion en el que el producto de la primera sea sutrato para esta, con la ventaja que en este caso si disponemos de un componente (habitualmente el NADH) que si da cambio en el espectro.
Hemos de tener enzima y NADH en exceso y tener en cuenta la estequiometria.
IV: FLUORESCENCIA.
Similar al anterior pero con instrumental menos frecuente y mas caro.
V. TURBIDIMETRIA.
Util especialmente para determinar la actividad de enzimas relacionados con la ruptura de la pared bacteriana.
VI. ENSAYO ELECTROQUIMICO.
Indicado cuando en la reaccio hay cambio en la concentracion de protones. Se utilizan electrodos para ver la diferencia. Se suele utilizar en continuo.
VII. ENSAYO RADIOMETRICO.
Actuan en discontinuo. Se basan en la presencia de isotopos radiactivos en una parte de la muestra.
VIII. HPLC.
Discontinuo. Se puede hacer en digestion de productos polimericos donde vamos viendo los grados de degradacion.
IX. ELECTROFORESIS.
El sustrato corre con la enzima, una vez hecha la separacion ponemos el gel a incubar en las condiciones optimas para el enzima de manera que teñiendo el sustrato veremos vacios en el lugar donde esta el enzima (?)
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VELOCIDAD DE LA REACCION:
Para hablar de velocidad inicial hemos de trabajar a tiempos de reaccion cortos (asi la variacion de la concentracion de sustrat es despreciable) ademas la concentracion de enzima ha de ser fija e inferior a la de sustrato.
ORDEN DE REACCION
Cuando la velocidad de la enzima ya no depende de la concentracion de sustrato tenemos orden cero.
Cuando la reaccion no es lineal podemos apreciar dos comportamientos:
CINETICA BURST. la velocidad aumenta o disminuye al cabo de un tiepo corto de reaccion.
CINETICA LAG. La reaccion comienza lenta y luego se dispara.
Esto puede ser debido a una temperatura inadecuada, a particulas en suspension, a detectores de respuesta lenta, etc.
PURIFICACION ENZIMATICA.
El enzima ha de ser estable, segun la fuente el proceso de purificacion será distinto. (fuentes: celulas eucariotas, fermentacon bacteriana, latex de plantas)
Metodos para la purificacion se basan en propiedades fisicoquimicas del enzima:
-CENTRIFUGACION: Masa.
-ELECTROFORESIS: Polaridad.
-CAMBIO pH: Solubilidad.
EL proceso a escoger ha de tener las menos etapas posibles y poniendo en primer lugar aquellas que separen con menos eficiencia mayor cantidad de producto. (las etapas mas especificas al final)
SISTEMAS DE EXPRESION DE PROTEINAS RECOMBINANTES:
Bacterias: levaduras; celulas de insecto con vectores baculovirus.
Y hasta aqui puedo leer. Para que no todo sea un tostón infumable para mi buen amigo Lluis, añado una bonica cancion de esas que escucho cuando hago estos resumenes.
Gracias a todos los que me han dado animos estos dias!
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